亮發(fā)光桿菌的冷凍干燥保藏法

（1）收集菌種：作為長期保藏的菌種，應(yīng)當(dāng)選擇zui適培養(yǎng)基和溫度以便得到良好的培養(yǎng)物。亮發(fā)光桿菌培養(yǎng)時間要掌握在生長后期，因為對數(shù)生長期的細(xì)菌對冷凍干燥的抵抗力較弱，有孢子的微生物需適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)以期得到成熟的孢子。大致說，細(xì)菌是24~48h，酵母為72h，放線菌和絲狀真菌是7~8天以上。從理論上說，是用生理鹽水或緩沖液將斜面上刮下的菌體或孢子洗幾次，以期洗凈培養(yǎng)基中可能帶來的各種物質(zhì)。但在實際操作中如果洗凈的條件不適宜會使細(xì)胞受損，同時也增加了污染的可能性，一般都省略了這一步驟。操作時先將少量分散劑（保護(hù)劑）加入斜面中，輕輕刮下菌苔或孢子，注意不要劃破斜面而帶入培養(yǎng)基，也可通過紗布脫脂棉的過濾，制成均勻的懸液。懸液的細(xì)胞濃度，因細(xì)菌和孢子大小不一，不易訂出統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌可保持在109~1010/ml左右，孢子應(yīng)盡可能分散從而制成20支安瓿管。如果用液體培養(yǎng)，則在離心后除去上清液，每10ml所得的菌體可加入1~2ml的分散劑。這個步驟中必需嚴(yán)格的遵守?zé)o菌操作和檢驗培養(yǎng)的程度，因保藏期較長，培養(yǎng)物不純或操作污染都會造成不良的后果。制成懸液后即在同樣嚴(yán)格的無菌條件下用毛細(xì)滴管加入滅菌好的安瓿管中，每個安瓿管裝量約為0.1~0.2ml，但不必準(zhǔn)確控制，通常加入3~4滴即可。

（2）安瓿管的準(zhǔn)備:冷凍干燥用的安瓿管形狀不一，有的是直形小管，有的在底部帶球形，有一些病原菌更需要在安瓿管內(nèi)再裝入很小的玻璃套以保證安全。安瓿管的內(nèi)徑為8~10mm，長度不小于100mm。安瓿管的玻璃要求中性、能耐熱、耐壓、耐溫度的驟變和管底厚度均勻，先用毛細(xì)滴管加入洗液浸泡，第二天用水及蒸餾水洗凈后干燥，瓶口加脫脂棉塞用紙包好，在121℃滅菌30min后，再在60℃烘箱中干燥。干燥溫度不宜過高以防止脫脂棉被烤焦。

（3）冷凍：裝入懸液的安瓿管應(yīng)立即冷凍，不宜放置過久。時間長了會使用菌體自行沉淀成為不均勻的懸液而不利冷凍，同時還會使分散劑起培養(yǎng)基的作用使微生物再次生長或萌發(fā)了孢子，這些情況都不利于長期保藏。冷凍的溫度達(dá)到-30℃以下即可，有冷凍干燥機的可在冷凍架上進(jìn)行，否則用一個盛有干冰的廣口熱水瓶將安瓿管在干冰中轉(zhuǎn)動幾下即可。冷凍后的安瓿管應(yīng)立即真空干燥。

（4）分散劑：分散劑或稱保護(hù)劑，其作用有二：一是使懸浮液懸浮其中保持活的狀態(tài)；二是減少冷凍干燥時對微生物引起的損傷。分散劑大致可分為低分子化合物如氨基酸、有機酸、糖類等；高分子化合物如蛋白質(zhì)、多糖等，原則上是二者配合使用的。ATCC及NRRL用馬血清、NCTC用1:3的營養(yǎng)肉湯和馬血清加入7.5%的葡萄糖。亮發(fā)光桿菌常用的是脫指牛乳和血清。zui簡單的是將普通牛乳離心后除去上層乳脂，常壓滅菌3次每次1h，溫度過高將影響保藏的效果。血清要過濾滅菌，牛乳可加熱滅菌且冷凍干燥后易形成均勻粉末故更為常用。

（5）真空干燥：真空干燥可用小箱式的冷凍干燥機，冷凍結(jié)束后立即啟動真空泵，在15min內(nèi)使小箱內(nèi)真空度達(dá)到0.5托，1托的真空度約為1mmHg（1mmHg=133.322Pa）以上。隨著真空度上升至0.1托以上，可以升高箱板的溫度，使小箱內(nèi)的溫度升至25~30℃。此時由于升華還在繼續(xù)，樣品不會融化而能達(dá)到干燥的目的。如果有后干燥裝置，可以利用油泵進(jìn)行后干燥，真空箱內(nèi)的真空度可達(dá)到0.01托以上，干燥效果更好。干燥完畢后關(guān)閉真空泵、排氣、取出安瓿管將管頸拉細(xì)，再裝在多孔管道上抽真空和融封。這種裝置每次可冷凍干燥大量安瓿管，干燥度和真空度都較高，每次需要的時間較長約在10h以上。

（6）離心式冷凍干燥機：另有一種帶離心機的冷凍干燥機，其主要區(qū)別是在真空箱內(nèi)裝有一個可插入安瓿管口棉塞，插入預(yù)冷至-30℃~-50℃的小箱內(nèi)離心機上。啟動離心機及真空泵，約15min后真空度達(dá)0.1托時，樣品已被冷凍。此時關(guān)閉離心機將樣品抽干，如有加溫裝置，則在關(guān)閉離心機后逐步加溫至25~30℃使樣品加速干燥，這種裝置可在數(shù)小時內(nèi)完成全部過程。它的主要優(yōu)點是在離心作用情況下抽真空，不會產(chǎn)生泡沫而影響冷凍干燥的效果，但是安瓿管數(shù)受離心插*的限制和污染的機會較多，并不常被采用。冷凍干燥的裝置還有鐘罩式等，其基本原理與操作均相同，不一一列舉。

（7）安瓿管的熔封：熔封必須在第二次抽真空情況下，在多孔管道上進(jìn)行。一般使用二或三個噴嘴的煤氣燈并由空氣壓縮機送入少量氧氣。熔封技術(shù)需很熟練，因為既要達(dá)到熔封*無任何泄漏，同時又要求外觀完整均勻。熔封是在棉塞下部安瓿管已拉細(xì)處。

（8）標(biāo)簽：安瓿管的標(biāo)簽應(yīng)當(dāng)予以必要的注意，在大量保藏菌種時不允許有任何的差錯。可以在滅菌前加入有菌名、日期的小紙片，亮發(fā)光桿菌zui簡單的是在加懸液前加入有菌名、日期的小條膠布。應(yīng)當(dāng)避免用水溶性的筆來寫標(biāo)簽。

（9）安瓿管的保藏及影響保藏因素：安瓿管可放在冰箱內(nèi)在4~5℃低溫下保藏。保藏期為5~10年。室溫保藏的效果不佳。影響保藏期的因素很多，菌種、菌齡、冷凍干燥過程中各個環(huán)節(jié)都與之有關(guān)。保藏期和菌種變異關(guān)，在冷凍干燥中主要是由于干燥樣品中含水量的影響。通常含水量在1~3%時較好，5~6%就會相應(yīng)降低，雖然不一定進(jìn)行含水量的測定，可用目測或真空度來控制，但應(yīng)當(dāng)引起必要的注意，此法保藏的菌種可以長期保藏菌種的穩(wěn)定，有報道（2）將保藏10年的12個屬的細(xì)菌進(jìn)行生理、生化、血清學(xué)的測定而沒有發(fā)生變異，許多用的放線菌生理、生化、血清學(xué)的測定而沒有發(fā)生變異，許多用的放線菌等微生物菌種亦都采用這種保藏方法達(dá)到長期保存的目的。

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